在水存在時，即樣品中的水與卡爾費休試劑中的SO2與I2產生氧化還原反應。
I2 + SO2 + 2H2O → 2HI + H2SO4
但這個反應是個可逆反應，當硫酸濃度達到0.05%以上時，即能發生逆反應。如果我們讓反應按照一個正方向進行，需要加入適當的堿性物質以中和反應過程中生成的酸。經實驗證明，在體系中加入吡啶，這樣就可使反應向右進行。
3 C5H5N+H2O+I2+SO2 → 2氫碘酸吡啶 + 硫酸酐吡啶
生成硫酸酐吡啶不穩定，能與水發生反應，消耗一部分水而干擾測定，為了使它穩定，我們可加無水甲醇。
硫酸酐吡啶 + CH3OH（無水） → 甲基硫酸吡啶
我們把這上面三步反應寫成總反應式為：
I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH → 2氫碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶
從反應式可以看出1mol水需要1mol碘，1mol二氧化硫和3mol吡啶及1mol甲醇而產生2mol氫碘酸吡啶、1mol甲基硫酸吡啶。這是理論上的數據，但實際上，SO2、吡啶、CH3OH的用量都是過量的，反應完畢后多余的游離碘呈現紅棕色，即可確定為到達終點。
I2︰SO2︰C5H5N = 1︰3︰10
2、卡爾費休試劑的配制與標定
若以甲醇作溶劑，則試劑中I2、SO2、C5H5N（含水量在0.05%以下）三者的克分子數比例為：I2︰SO2︰C5H5N = 1︰3︰10
這種試劑有效濃度取決于碘的濃度。新配制的試劑其有效濃度不斷降低，其原因是由于試劑中各組分本身也含有一些水分，但試劑濃度降低的主要原因是由一些副反應引起的，較高消耗了一部分碘。
這也說明了配制這種試劑要單獨配，分甲乙兩種試劑并且分別貯存，臨用時再混合，而且要標定。但我國市場上使用的卡爾費休水份測定試劑，無論是單組份的，還是雙組份的一般都由廠家已經調配好的可直接使用產品，但由于卡爾費休試劑是一種很不穩定的混合物質，因此用戶在使用時都必須進行標定，以測定其真實的水當量數據。
卡爾費休法測定水份，需要注意如下幾點：
① 此法適用于多數有機樣品，包括食品中糖果、巧克力、油脂、乳糖和脫水果蔬類等樣品；
② 樣品中有強還原性物料，包括維生素C的樣品不能測定；樣品中含有酮、醛類物質的，會與試劑發生縮酮、縮醛反應，必須采用的醛酮類試劑測試。對于部分在甲醇中不溶解的樣品，需要另尋合適的溶劑溶解后檢測，或者采用卡氏加熱爐將水份汽化后測定。
③ 卡爾費休法不僅可測得樣品中的自由水，即此法測得結果更客觀地反映出樣品中總水分含量。
④ 固體樣品細度以40目為宜，用粉碎機而不用研磨，防止水分損失。
